客户文章丨FDISCO组织透明化技术助力揭示一种可用于中枢神经系统药物递送新方式

探究颅骨骨髓-硬脑膜-类淋巴通路是否可用于药物转运，作者通过ICO注射（图1a）或静脉（IV）注射向小鼠注射5微升10% EB溶液。尾静脉注射后10分钟、30分钟和60分钟，在小鼠肢体和尾部观察到伊文思蓝，但IV组的脑组织中未观察到。ICO注射后10-60分钟，在小鼠脑内观察到伊文思蓝（图1b）。值得注意的是，当注射相同体积的EB溶液时，ICO组在所有测试脑区（如颅骨和硬脑膜、小脑、皮层、纹状体和海马）中的EB浓度均高于IV组，血浆除外（图1c）。ICO注射后EB含量在1小时达到峰值，随后逐渐下降（图1d和e）。

为评估ICO注射的副作用，作者观察了注射部位周围皮肤，在假手术或pMCAO小鼠中，ICO注射24小时后注射部位未见红肿或渗出。此外，作者检测了颅骨骨髓和外周血中中性粒细胞比例及炎症细胞因子（IL-1β和TNF-α）水平（图2a和b）以评估ICO注射引起的炎症反应。流式细胞术显示，ICO注射24小时后颅骨骨髓和外周血中中性粒细胞比例无显著变化（图2c）。在ICO注射1天和3天后用ELISA检测颅骨和血清中IL-1β和TNF-α水平，无论是假手术组还是pMCAO模型组结果均无变化（补充图S1a-d）。这些结果表明ICO注射未引起颅骨感染。

当BBB开放时，物质可进入脑内。因此，作者通过注射不同分子量（4 kDa、40 kDa、150 kDa）的FITC-葡聚糖（图2d）和HRP（44k Da）检测BBB的完整性。示踪剂在血管周围的渗漏量可反映BBB通透性，作者发现假手术组和假手术-ICO组中无示踪剂渗漏，而pMCAO组中FITC荧光（图2e）和HRP的渗漏量与pMCAO-ICO组相同。4 kDa、40 kDa和150 kDa FITC-葡聚糖以及HRP的结果均支持ICO不影响BBB通透性。

为明确ICO注射至脑实质的递送途径，需全面检查颅骨、硬脑膜和脑组织。作者采用Cy3标记的多肽PSD95抑制剂NA-1。ICO注射NA1-Cy3后1小时获取颅骨-硬脑膜-脑复合体并进行组织透明化处理以缓解钙化颅骨导致的成像问题（图3a和b）。发现NA1-Cy3存在于颅骨、颅骨与硬脑膜之间的微通道、硬脑膜和脑实质中，且颅骨骨髓中的浓度高于脑实质。此外，使用Lyve1-AF488和CD31-AF647分别标记透明化组织中的脑膜淋巴管和血管，随后使用佳维斯（武汉）生物医药有限公司的FDISCO组织透明化试剂盒对颅骨和脑组织进行整体透明成像（图3b），结果发现NA1-Cy3位于脑实质周围以及颅骨髓腔和微通道中的血管周围，不与CD31共染色（黄色箭头）（图3c和d），表明荧光标记药物通过颅骨与硬脑膜之间的微通道绕过BBB进入脑实质。我们发现ICO注射药物不依赖血液途径，而是通过血管周围空间绕过BBB，这与CSF通过血管周围空间进入硬脑膜一致。

在大鼠pMCAO脑卒中模型中评估了ICO注射的可行性、安全性和有效性，并选择PSD95抑制剂作为脑卒中的治疗药物。通过抑制PSD95，可破坏PSD95-NMDR-nNOS复合物的形成，从而减少神经毒性损伤。 NA-1（多肽，分子量：2518.88）和Y-3（化合物，分子量：463.13）是两种不同类型的PSD95抑制剂。临床前研究表明，在脑卒中急性期给予NA1/Y-3可大程度减少损伤。NA-1是一种20个氨基酸的多肽，通过干扰PSD95蛋白发挥神经保护作用，在临床前缺血再灌注脑卒中模型中显示出疗效。Y-3可轻松穿过血脑屏障，能选择性阻断缺血诱导的nNOS-PSD-95相互作用，在体外表现出强效神经保护活性，并可改善小鼠和大鼠MCAO及再灌注后的局灶性脑缺血损伤。给药24小时后，通过TTC染色标记脑梗死区域。与IV组相比，当NA-1或Y-3的剂量分别为3.9毫克/千克或0.1毫克/千克时，ICO组的梗死面积、mNSS评分和脑含水量更低。大鼠处理后7天内（图4a）。尽管ICO组与IV组在存活率（图4b和g）或体重变化（图4c和h）上无差异，但Y3-ICO组在第1天和第3天的神经功能评分更好（图4d），且在第3天和第5天的旋转棒测试中掉落时间更长（图4e）。此外，NA1-ICO组在第1天的神经功能缺损更轻（图4i），且第7天的旋转棒测试掉落时间更长（图4j）。我们还观察到，与IV注射相比，ICO注射Y-3（图4f）和NA-1（图4k）分别使脑梗死面积减少40%和37%。此外，我们评估了不同注射组的肝功能（补充图S3a）和肾功能（补充图S3b），发现ICO组与IV组之间无差异。这些数据表明，ICO注射神经保护剂作为脑卒中治疗方法是可行、安全且高效的。

通过高效液相色谱（HPLC）检测IV/ICO注射后组织中Y-3的浓度。发现脑卒中模型中，ICO组血浆Y-3浓度在注射后1-4小时低于IV组（图5a）。此外，组织与血浆分配系数（Kp）显示的Y-3分布表明，ICO组在颅骨、硬脑膜和CSF中呈下降趋势（图5b），而在小脑、皮层、纹状体、海马和深部颈淋巴结中呈上升趋势（图5c）。我们使用FITC标记的NA-1和Y-3观察ICO注射的药物量，发现IV组大部分FITC药物保留在血管中，而ICO组药物进入神经元（图5d和g）。这表明与IV组相比，ICO导致FITC分子数量（图5e和h）和细胞内摄取FITC的神经元数量（图5f和i）增加。由于PSD95抑制剂可解耦PSD95和NMDR，并抑制脑卒中后nNOS的表达，我们在注射NA-1/Y-3后24小时检测pMCAO模型脑组织中的nNOS（补充图S4a）。荧光强度的半定量分析表明，ICO注射NA-1/Y-3后脑组织中nNOS的表达降低（补充图S4b）。脑卒中后，神经元因缺血缺氧逐渐发生程序性死亡。通过Capase3和NeuN免疫荧光染色共标记pMCAO模型中的凋亡神经元（补充图S4c）。数据显示，第7天颅骨骨髓注射Y-3后凋亡细胞和凋亡神经元减少（补充图S4d）。简而言之，ICO注射PSD95抑制剂似乎减少了脑卒中后nNOS的表达和随后的神经元凋亡。