Nature丨颠覆认知！组织透明化成像首次揭示中性粒细胞介导血管阻塞、肿瘤坏死及转移进程

多项研究表明，原发性肿瘤坏死与多种癌症的不良预后相关。作者通过对200例乳腺癌患者的磁共振成像（MRI）分析发现，存在肿瘤坏死的患者无复发生存期和总生存期更短，且腋窝淋巴结肿大发生率更高（提示区域淋巴结转移）。

为探究乳腺癌坏死与预后的关系，作者采用组织透明化成像技术对原位植入三阴性乳腺癌（TNBC）4T1细胞的小鼠模型进行分析。坏死区域表现为核形态破坏、血管缺失及中性粒细胞大量浸润（扩展数据图1b,c）。通过成像质谱流式技术确认，这些浸润细胞确为中性粒细胞。坏死区及周边存在丰富的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），其特征为髓过氧化物酶（MPO+）、瓜氨酸化组蛋白3（citH3+）和DNA（DAPI+）共定位（图1a,b）。这种坏死的空间构型复杂，与传统"远离血管的中央坏死核心"理论不符（图1b），作者将其命名为"多形性坏死"。

在其他肿瘤模型（C57BL/6小鼠Lewis肺癌、FVB/n背景C3(1)-Tag自发乳腺癌模型）中也观察到类似的多形性坏死结构和血管内中性粒细胞/NETs聚集，但MMTV-PyMT模型未见此现象。值得注意的是，4T1肿瘤多形性坏死区血管内存在中性粒细胞/NETs聚集（图1c,d）。通过静脉注射罗丹明标记凝集素进行血管灌注实验显示，中性粒细胞聚集下游血管无灌注（图1e），且聚集数量与无灌注血管范围（图1f）及局部缺氧程度正相关，提示中性粒细胞通过阻塞血管引发缺血性坏死。

肿瘤坏死在癌症患者和动物模型中均与转移相关，但坏死癌细胞本身无法转移，因此我们重点分析了坏死周边区域的变化。值得注意的是，多形性坏死肿瘤的周边区域比传统中央坏死肿瘤更广泛（扩展数据图4a）。缺氧区域几乎全部位于坏死周边（图2a），因此我们以缺氧作为坏死周边的标志。在4T1肿瘤单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据中，缺氧癌细胞除表达Hif1a和Vegfa外，还高表达Cxcl1、Ddit4、Egr1（诱导TGFβ表达）、Mcl1、Tnc（促进肿瘤迁移）、Limd1（抑制E-cadherin表达）和Ltbp1（增强TGFβ活性并促进上皮-间质转化（EMT））。基因本体分析显示缺氧癌细胞差异表达基因涉及迁移、TGFβ信号和EMT通路。在C3(1)-Tag肿瘤scRNA-seq数据中也发现类似基因变化。

通过检测EMT标志物发现，4T1、LLC和C3(1)-Tag肿瘤坏死周边区域E-cadherin表达降低而vimentin升高（图2b-g）。人类TNBC单细胞测序数据和穿刺活检结果与此一致（图2h-k）。所有转录组分析均显示TGFβ响应特征，且TGFβ蛋白在4T1肿瘤坏死周边缺氧区域富集。

4T1肿瘤空间转录组分析明确区分了坏死区、周边区和非坏死区（图3a-c），周边区特异性高表达EMT相关基因Vim和Twist1（图3d-e），通路富集分析证实缺氧、迁移和EMT相关通路激活（图3f）。人类非小细胞肺癌数据分析显示，中性粒细胞富集区（代表坏死区）附近的癌细胞同样呈现促转移转录特征。

为验证TGFβ的作用，我们构建了表达显性负性TGFβ受体（dnTGFβR2）的4T1细胞。虽然dnTGFβR2肿瘤的坏死程度和NETs形成未受影响（图3g-h），但周边区EMT标志物改变消失，肺转移显著减少（图3i）。通过多组学技术证实，坏死周边区TGFβ主要由巨噬细胞分泌。

在荷瘤小鼠中性粒细胞的表型改变中，最令人意外的是血液中出现Ly6G高Ly6C低的亚群（中性粒细胞通常高表达Ly6C，但低于单核细胞）。这种Ly6C低中性粒细胞仅存在于4T1和LLC荷瘤小鼠（图4a）。通过RNA-seq分析发现，Ly6C低中性粒细胞高表达Cyria（Rac1抑制剂）、Dok1（抑制整合素活化）、Icam1（细胞黏附分子）、Itgax（CD11c）和Itga4（纤连蛋白受体），低表达Ly6c1/2等基因（图4b）。基因本体分析显示差异基因涉及炎症反应、翻译调控及细胞迁移通路，而外渗相关通路显著下调（图4c）。流式检测证实Ly6C低中性粒细胞表面CD62L、SiglecF、CXCR2、CXCR4、ICAM1和CD11c表达改变。

时序分析显示，Ly6C低中性粒细胞在4T1细胞植入后第9天即出现（4,595±379个/毫升血液），与原发性肿瘤多形性坏死发生同步（图4d）。该群体核形态成熟，吞噬和活性氧产生能力正常，但经PMA刺激后更易形成NETs（图4e）。在腹膜炎模型中，Ly6C低中性粒细胞表现出外渗缺陷（图4f-g），活体显微观察也显示其组织浸润能力降低，但其循环半衰期延长至28.8小时（Ly6C高群体为14.6小时）。抗体阻断实验证实Ly6C直接调控外渗过程。

由于Ly6C低中性粒细胞高表达纤维蛋白原受体CD11c和ICAM-1，其纤维蛋白结合能力增强，与血小板聚集及NETs形成效率更高。值得注意的是，Ly6C中群体表现出中间表型：虽保留部分外渗能力，但纤维蛋白黏附和NETs形成倾向与Ly6C低群体相似。这些数据支持Ly6C低中性粒细胞通过黏附血管内纤维蛋白/基底膜成分、与血小板互作及形成NETs，最终导致血栓炎性血管闭塞的模型。

Cxcl1敲除荷瘤小鼠循环Ly6C低中性粒细胞减少，伴随肿瘤坏死和肺转移减轻，而dnTGFβR2肿瘤不影响该群体，提示其位于TGFβ信号上游。人类乳腺癌scRNA-seq数据分析发现，与小鼠Ly6C低特征匹配的中性粒细胞亚群（cluster 3）主要存在于血液而非肿瘤组织（图4h-i），同样显示外渗能力下降（图4j）。

NETs（中性粒细胞胞外诱捕网）在包括癌症在内的多种疾病中可诱发血管阻塞。鉴于Ly6C低中性粒细胞具有血管限制性且更易形成NETs，加之血管内NETs聚集确实阻塞血流，我们假设NETs的血管内释放驱动了原发性肿瘤的血管阻塞（继而导致多形性坏死）。

为验证该假说，我们构建了中性粒细胞特异性缺失PAD4（NETs形成关键酶）的小鼠模型（MRP8Cre;Padi4fl/fl，简称PAD4ΔN）。将LLC癌细胞移植至PAD4ΔN与野生型（PAD4WT）小鼠4周后，尽管肿瘤体积差异不大，但PAD4ΔN小鼠肿瘤中瓜氨酸化NETs完全缺失。关键的是，PAD4ΔN小鼠肿瘤在中性粒细胞富集区未出现血管损伤，而野生型小鼠肿瘤坏死面积高达60%（图5a-d）。肺转移分析显示，PAD4ΔN小鼠转移灶数量和负荷显著降低，但病灶平均大小不变（图5e-h）。通过尾静脉注射实验证实，这种差异源于原发瘤释放的癌细胞减少，而非转移灶生长受限。

RNA-seq分析表明，野生型小鼠坏死周边区域的癌细胞高表达Cxcl1、Cxcl2、Ncam1和Rhoq等基因，涉及代谢重编程、细胞迁移和EMT通路（图5i）。PAD4ΔN小鼠肿瘤中EMT标志物（vimentin升高/E-cadherin降低）的改变完全消失。为排除PAD4非依赖性NETs的影响，使用DNase I处理同样减少肿瘤坏死和转移。进一步采用FDA批准药物双硫仑（可阻断NETs形成）干预，证实其能降低4T1肿瘤NETs水平、减少坏死和肺转移，但不影响原发瘤生长或转移灶大小。